1. G/C指基因组拷贝数(genomic copies GC)与活菌数(colony forming units CFU)的比值；贜AT的步骤可检测样本中支原体核酸的拷贝数（GC)，不思考细菌细胞的活率；而基于药典造就法只能检测活菌数（CFU）。NAT-based步骤的 limit of detection (LOD)通常表白为最低数量的基因组拷贝(GC)，而药典造就法的LOD则为最低活菌数(CFU)； 2. 支原体样本中GC/CFU可能有很大差距，较低的GC/CFU反映了支原体较高的活率和较低的荟萃水平。因而，在使用NAT步骤与药典步骤进行可比性钻研时，应使用低GC?CFU的支原体尺度株？⒑驮毂敢蛔榈虲G?CFU比的活支原体参考株，对于评价和验证基于NAT的支原体检测步骤拥有沉要意思。
中国药典ChP：支原体查抄仅蕴含造就法和批示细胞法，未明确NAT步骤能够代替传统步骤，也未对NAT步骤作出规范； 欧洲EP2.6.7及美国药典USP<77>：明确NAT步骤在经过肯定验证后可代替传统查抄步骤（造就法、批示细胞法），目前新的领导准则中，对于NAT步骤验证中的尺度株有新的划定，G/C比低于10；
EP 2.6.7建议使用与支原体亲缘关系较近的菌株，蕴含梭菌、乳酸杆菌和链球菌等革兰氏阳性菌；
准则上抽样设计与步骤学检测活络度以及风险节造设计有关。由于必要思考低传染水平前提下的检出，因而难以用正态散布方式来估计检出概率，泊疏松布比力适合用于该情况下的传染及检出概率估计。抽样设计上必要结合批出产量，取样体积，抽样数量，和步骤学检测限来综合估计检出概率，基于风险水平，设计抽样放行法子。
假阳性产生原因：1. 样本中存在支原体核酸或者死菌；qPCR步骤能够检测到支原体核酸或者死菌，而药典造就法只能检测到活菌导致检出差距；2.前处置过程传染导致假阳性。 例如血清产品，经过了药典造就法验证为阴性，但荧光定量qPCR法测试有时会汇报呈阳性，这是由于血清产品的出产工艺能有效去除微生物颗粒，蕴含支原体这类最幼的微生物，但是对于微生物细胞破碎后的核酸残留碎片不能有效去除，因而有可能出现上述假阳性景象； 建议：1. 对于可能在样本基质中含有微生物核酸残留的样本，建议用高速离心去基质的步骤查抄，以躲避假阳性汇报。通常情况下，16000g，20min离心前提对目前已知的支原体种类能够回收99%以上的支原体，而核酸会保留在离心后的上清中；2. 对于前处置存在传染的情况，能够通过NCS样本监控前处置过程，排除假阳性了局。
1.磁珠充分混匀，使用过程把稳观察磁珠状态，聚团或者是弥散均必要对样本的基质进行分析钻研；聚团情况必要齐全震散，尤其是洗脱步骤；弥散状态必要对样本进行稀释或者是选取16000g离心的方式齐全去基质保留支原体； 2.RC的使用，必须与PC为统一批次，保障了局的一致性
1. 支原体检测样本通常是造就上清、细胞、冻液、TEbuffer等，前处置配方在该基质上面更有利，无酶水作为基质，磁珠的吸附的信号慢一些，后续试验能够适当耽搁磁吸功夫 2.支原体试剂盒磁珠粒径较幼， 磁吸功夫必要稍微耽搁，通常必要3min左右，进一步保障回收率 3. .Wash buffer中乙醇浓度简直认，盐浓度较高会导致磁吸失败 4. 洗脱样本中乙醇的残留情况，乙醇会产生扩增抑造
由于相对扩增后的产品浓度极高，更容易造成传染和假阳性，因而通过UNG/UDG酶催化水解扩增后已经掺入尿苷酸的DNA产品，使得扩增产品无法进一步扩增，而达到预防气溶胶传染的主张。
蛋白、离子，出格是二价离子，螯合剂、乙醇、甘油、异丙醇、pH等；
影响扩增效能的成分好多，任何一个影响反映的成分，好比：酶，缓冲液等城市影响扩增效能，但是对于商品化试剂，试剂的组分影响已经经过了充分查核验证。因而，在合理保留的产品效期内，更换操作人员出现的扩增效能变动，更多源于每次校准曲线各浓度点配造误差。此表仪器设备未经过定期校验，可能会出现个别扩增孔位不不变，或者由于尝试室电压不不变，造成检测颠簸。
